Дипломная работа: ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ СИНТАКСИНА 6 С МЕМБРАННЫМИ БЕЛКАМИ СЕКРЕТОРНЫХ ГРАНУЛ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА

Содержание
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика нейтрофилов человека
1.2. Внутриклеточные гранулы нейтрофилов человека
1.3. Современные представления о механизмах слипания/слияния мембран
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ МОДЕЛИ
2.1. VAMP/ синаптобревин
2.2. Синтаксины
2.3. SNAP-25
2.4. NSF
2.5. SNAP
2.6. Механизм слипания/ слияния мембран
3. МЕТОДЫ
3.1. Объекты исследования
3.2. Выделение нейтрофилов человека
3.3. Электрофорез белков
3.4. Иммуноблоттинг
3.4.1. Перенос фракций из геля на фильтр
3.4.2. Иммунное выявление антигенов на фильтре
3.4.3. Активация нейтрофилов
3.4.4. Иммунопреципитация
4. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Дата добавления на сайт: 27 июня 2024

Скачать работу 'ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ СИНТАКСИНА 6 С МЕМБРАННЫМИ БЕЛКАМИ СЕКРЕТОРНЫХ ГРАНУЛ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА':

Министерство общего и профессионального образования Российской Федерации
Мордовский ордена дружбы народов государственный университет
имени Н.П. Огарева
Факультет биологический
Кафедра генетики
Утверждаю
Зав. кафедрой
д.б.н., профессор Трофимов В.А..
«___»____________2001 г.
Дипломная работа
тема: Изучение взаимодействия синтаксина 6 с мембранными белками секреторных гранул нейтрофилов человека
Автор дипломной работы: Сальникова Е.Н.
Обозначение дипломной работы: ДР-2069965-011600-14-01 группа 501
Специальность: 011600
Руководитель работы: д.б.н., профессор Набокина С.М.
Нормоконтролер: к.б.н., доцент Мышляков Г.М.
Рецензент: д.б.н., профессор Шубина О.С.
Саранск 2001
МОРДОВСКИЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.П. ОГАРЕВА
факультет иностранных языков
кафедра английского языка
Утверждаю
Зав.кафедрой
д.б.н., профессор Трофимов В.А.
«____»___________ 2001
ЗАДАНИЕ НА ДИПЛОМНУЮ РАБОТУ
Студентка Сальникова Елена Николаевна группа 501
Тема: Изучение взаимодействия синтаксина 6 с мембранными белками секреторных гранул нейтрофилов человека.
Срок представления работы к защите: 20.06.2001 г.
Исходные данные для дипломной работы: литературные материалы, публикации в периодической печати.
Содержание дипломной работы:
Список использованных сокращений
Введение
Обзор литературы
Характеристика основных белковых компонентов модели
Методы
Полученные результаты и их обсуждения
Выводы
Список использованных источников
Руководитель работы: ________________________С.М. Набокина
подпись, дата д.б.н., профессор
Задание принял к исполнению: __________________Е.Н. Сальникова
подпись, дата
Реферат
Дипломная работа содержит 44 страницы машинописного текста, 5 рисунков, 2 таблицы, 48 использованных источников, из них – 40 иностранной литературы.
Перечень ключевых слов: нейтрофилы, экзоцитоз, взаимодействие белков, snare, vamp-1, синтаксин 6, snap-25, snap-23.
Объекты исследования: нейтрофилы периферической крови человека.
Цель работы: изучение взаимодействия белок-белковых взаимодействий между синтаксином 6 и другими белками группы snare in vivo.
Методы исследования: выделение из нейтрофилов человека snare комплексов при помощи иммунопреципитации на моноспецифических антителах против синтаксина 6, присоединенных к протеину а-агарозе и их харакетристика.
Полученные результаты: выявлены взаимодействия синтаксина 6 с vamp-1, snap-23 и snap-25.
Список использованных сокращенийБЛМ – бислойные липидные мембраны
ПМЯ – полиморфно-ядерные лейкоциты
SNAP – белок цитозоля, связывающийся с NSF
NSF – фактор, чувствительный к N-этилмалеимиду
SNARE – рецептор для SNAP
SNAP-25 – белок с молекулярной массой 25 кДа, ассоциированный с синаптосомами
SNAP-23 – белок с молекулярной массой 23 кДа, ассоциированный с синаптосомами
VAMP – мембранный белок, ассоциированный с везикулами
МПО – миелопероксидаза
ФМА – 4бетта-форбол 12-миристат 13-ацетат
ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид
ДДС-Na – додецилсульфат натрия
ПААГ – полиакриламидный гель
ТЕМЕД – N, N, N, N – тетраметилэтилендиамин.
Содержание
TOC \o "1-3" Список использованных сокращений
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Общая характеристика нейтрофилов человека
1.2. Внутриклеточные гранулы нейтрофилов человека
1.3. Современные представления о механизмах слипания/слияния мембран
2. Характеристика основных белковых компонентов модели
2.1.VAMP/ синаптобревин
2.2.Синтаксины
2.3.SNAP-25
2.4.NSF
2.5. SNAP
2.6.Механизм слипания/ слияния мембран
3. Методы
3.1.Объекты исследования
3.2. Выделение нейтрофилов человека
3.3. Электрофорез белков
3.4. Иммуноблоттинг
3.4.1. Перенос фракций из геля на фильтр
3.4.2. Иммунное выявление антигенов на фильтре
3.4.3. Активация нейтрофилов
3.4.4. Иммунопреципитация
4. Полученные результаты и их обсуждение
Выводы
Список использованной литературы
ВведениеНейтрофилы и продукты их секреции принадлежат к числу центральных участков воспаления. Они играют ключевую роль в защите организма, поглощая и разрушая чужеродные клетки и бактерии. Нейтрофилы человека содержат четыре типа гранул: азурофильные, специфические, желатиназные гранулы, а также везикулы которые в разной степени способны претерпевать экзоцитоз в ответ на повышение внутриклеточной концентрации ионов Са+.
В настоящее время для объяснения молекулярного механизма экзоцитоза в нейтрофилах используется SNARE гипотеза. Эта модель основана на взаимодействии белков мембраны секреторной везикулы и белков плазматической мембраны с последующим связыванием цитозольных белков, приводящая к слиянию мембран. Группу SNARE составляют белки, относящиеся к семействам:
семейство VAMP (Vesicle – Associated Membrane Protein),
семейство SNAP-25 (Synaptosome – Associated Protein of 25 кДа),
семейство синтаксинов.
В настоящее время в нейтрофилах человека идентифицированы множественные изоформы SNARE белков.
Обнаружено, что нейтрофилы человека экспресируют широкий набор белков семейства синтаксинов и установлена внутриклеточная локализация для двух представителей этого семейства: синтаксина 4 и 6. В последние годы в литературе появились сведения о взаимодействии синтаксина 4 с VAMP-2, SNAP-25 и SNAP-23. Что касается белка синтаксина 6, то в настоящее время взаимодействия этого белка с другими белками группы SNARE, не изучены. Поэтому целью данной дипломной работы явилось изучение белок-белковых взаимодействий между синтаксином 6 и другими белками группы SNARE in vitro, т.е. в интактных клетках.
1. Обзор литературы1.1. Общая характеристика нейтрофилов человекаНейтрофилы (полиморфно-ядерные лейкоциты, ПМЯ) и продукты их секреции принадлежат к числу центральных участков воспаления. Они играют ключевую роль в защите организма, поглощая и разрушая чужеродные клетки и бактерии [3].
Нейтрофилы имеют ряд характерных черт. Это присутствующие в большом количестве подвижные, короткоживущие клетки, способные к хемотаксису и фагоцитозу [1]. Общий вес нейтрофилов у одного человека составляет 1,5 кг [6. Эти клетки являются источником медиаторов воспаления, включая цитокины, и токсичных продуктов, таких как радикалы кислорода и гидролазы. В норме лизосомные ферменты и окислительные агенты нейтрофилов, продуцированные при запуске фагоцитоза, осуществляют внутриклеточный катаболизм белков и других макромолекул, деградацию фагоцитированных вирусов и бактерий. В норме нейтрофилы находятся в неактивном, спокойном состоянии.
При патологических состояниях функции этих клеток усиливаются. При этом происходит интенсивное генерирование и высвобождение медиаторов воспаления в межклеточное пространство. Инициация каскадных протеолитических реакций и продукция биологически активных пептидов, связанно с этими процессами, приводят к развитию воспаления [7].
1.2. Внутриклеточные гранулы нейтрофилов человекаНейтрофилы человека содержат четыре типа гранул: азурофильные, специфические, секреторные везикулы и желатиназные. Последние два типа были обнаружены в последние 10 – 15 лет с помощью субклеточного фракционирования и иммуно-электронной микроскопии. Гранулы, принадлежащие к разным типам, отличаются размером, морфологией, составом и способностью к мобилизации. Классификация азурофильных и специфических гранул основывалась на сродстве гранул к основному красителю азуровому А, содержании в гранулах миелопероксидазы и очередности появления гранул в ходе миелопоеза.
Желатиназные гранулы, формируемые на стадии палочкоядерных клеток, мобилизуются более быстро, чем специфические гранулы, образуемые на стадии миелоцитов и метамиелоцитов, а специфические гранулы, в свою очередь, мобилизуются более быстро, чем азурофильные гранулы, появляющиеся на стадии промиелоцитов.
Гранулы ПМЯ содержат большое количество различных ферментов, а именно протеолитические ферменты являются наиболее деструктивными [1].
Таблица 1.1.
Субклеточная локализация белков и ферментов в ПМЯ (Белова, 1997).
Класс Азурофильные гранулы Специфические гранулы
Бактерицидные ферменты Миелопероксидаза
Лизоцим Лизоцим
Протеиназы Эластаза
Катепсин G
Протеиназа З
Катепсин В
Катепсин Д Коллагеназа
Другие гидролазы N-Ацетил--глюкозаминидаза
-глюкоуронидаза
-глицерофосфатаза
-маннозидаза
Сульфатазы
Нуклеазы Щелочная фосфотаза
Другие белки Лактоферрин
Белки, связывающие витамин В12 2-микроглобулин
Ферменты нейтрофилов, действуя совместно, могут разрушать эластин, коллаген и различные другие белки, активировать комплемент, образовывать кинины из различных кининогенов, а также повышать проницаемость сосудов [8].
В азурофильных гранулах нейтрофилов и моноцитов содержится также миелопероксидаза (МПО) – гемопротеин с молекулярной массой 150 кДа; этот фермент катализирует окисление ионов гамедов (в особенности J-) до гипогаметов [3]. В сочетании с Н2О2 и гамедами, особенно иодидом и бромидом, МПО токсична для различных клеток, в том числе для микроорганизмов, опухолевых клеток, нормальных эритроцитов, тромбоцитов и других лейкоцитов. Хотя фагоцитирующие клетки обычно продуцируют пероксид водорода (Н2О2), бактерии, не продуцирующие каталазы, способны вырабатывать достаточное количество Н2О2 для собственного разрушения [8]. Продукты окисления системы МПО могут также вызывать высвобождение васоактивных аминов из тромбоцитов и тучных клеток [6]. МПО обладает рядом других функций, например она инактивирует окисление хемотаксических олигопентидов, содержащих метионин [39]. Специфические гранулы нейтрофилов содержат лактоферрин – белок с молекулярной массой 90 кДа, в котором имеется два участка, связывания железа. Этот белок высвобождается во внеклеточное пространство вместе с другими ферментами гранул [2]. Железо, связанное с лактоферрином, может играть определенную роль в генерации ОН из О2 и Н2О2.
Другим важным ферментом нейтрофилов, играющим, по-видимому, определенную роль в развитии устойчивости к бактериальной инфекции, является лизоцим. Лизоцимы – это ферменты, растворяющие различные гликозидные связи между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой, что ведет к лизису клеточных стенок микроорганизмов, а также и к существенному воздействию на мембраны клеток млекопитающих [22].
Учитывая содержимое гранул обоих типов, можно заметить, что набор этих ферментов достаточен для деградации многих или всех липидов, полисахаридов и белков чувствительных бактерий, часто приводящей к деструкции. Эти ферменты могут действовать как внутри клетки, так и вне ее. Если фермент функционирует внутри клетки, частица, доставляется в клетки фагосомой. При продвижении содержащей частицы фагосомы внутрь клетки она сливается с азурофильными и специфическими гранулами и образует фаголизосому; при этом частица, содержащаяся в фагосоме подвергается действию ферментов и других веществ, находившихся в гранулах. Гранулы формируются в аппарате Гольджи на промежуточной стадии развития в костном мозге. Слияние фагосом со специфическими гранулами происходит через 30 с после начала фагоцитоза, тогда как слияние с азурофильными гранулами через 1-3 мин. [1].
Многие из ферментов специфических гранул наиболее активны при нейтральном или щелочном рН, тогда как большинство ферментов азурофильных гранул наиболее активны при кислых значениях рН.
Высвобождение из клетки гранулярных ферментов легче всего наблюдать при усиленном фагоцитозе, когда вновь фагоцитируемые частицы попадают в уже сформированную фаголизосому [2]. Изучение высвобождения содержимого гранул в среду часто проводят в присутствии цитохалазина В; нейтрофилы превращаются в клетки с низкой фагоцитирующей активностью, легко высвобождающие продукты гранул в среду. Высвобождение гранулярных ферментов можно наблюдать и без цитохалазина В – под влиянием самых различных частиц. К числу наиболее эффективных стимулов относятся содержащие молекулы JgG крупные комплексы антигена с антителом [1]. Высвобождение ферментов из специфических гранул происходит в целом с большей интенсивностью чем у азурофильных гранул. Большинство стимулов вызывает одинаковое высвобождение ферментов из специфических и азурофильных гранул, среди них есть и такие, которые индуцируют специфические гранулы, например Кон А, ФМА.
Ферменты нейтрофилов способны функционировать как внутри клетки при фагоцитозе, так и вне клетки при экзоцитозе.
Гранулы нейтрофилов являются источником важных мембранных белков – рецепторов, антигенов, ферментов. В ходе экзоцитоза эти белки встраиваются в плазматическую мембрану нейтрофила и значительно изменяют способность клетки к взаимодействию с ее окружением.
1.3. Современные представления о механизмах слипания/слияния мембранСлипание и слияние мембран – универсальный и нормальный процесс, важная стадия гетерологического и гомологического межмембранного взаимодействия в ходе экзоцитоза; в ходе аутоиммуных реакций (например, при слиянии макрофагов с лимфоцитами).
Механизмы слияния клеточных и модельных (искусственных) мембран включает в себя одни и те же стадии, что указывает на универсальный механизм взаимодействия мембран. Эти же механизмы распространяются и на слияние мембран внутриклеточных органелл, везикул с плазмалеммой, где важно учитывать специфические подготовительные стадии, ведущие к слиянию. Механизмы слияния в системах клетка-клетка, клетка-везикула (чаще всего секреторные гранулы), везикула-везикула, везикула-плазмалемма, везикула-плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ), БЛМ-БЛМ. Слияние, вероятно, происходит только в специфических участках липидного бислоя мембран. Основной эндогенный фактор слияния – ионы Са – резко снижает гидротационный барьер при слиянии мембран. Кроме того, ионы Са снижают (или нейтрализуют) отрицательный поверхностный заряд, непосредственно модифицируют структуру липидного бислоя, вызывают разделение липидов в бислоях, дестабилизируя их; создают кальциевые мостики между двумя контактирующими мембранами, индуцируя слияние.
Полярные амфидильные молекулы (ненасыщенные жирные кислоты, моноацилглицерин), поликатионы (полилизин), углеводороды (декан), продукты перекисного окисления липидов, диметилсульфоксид, являются индукторами слияния. Процессы слияния предваряются агрегацией везикул, слипанием (адгезией) мембран. Процессам слияния сопутствуют высвобождение содержимого везикул в наружный раствор.
Сам акт слияния включает несколько стадий: частичное (полуслияние и полное слияние, сопровождающееся на последних этапах стабилизацией переходных структур, появлением особых кохлеарных внутримембранных частиц и самое главное, объединением внутренних объемов клеток или везикул. Снижение плотности поверхностного заряда, увеличение ионной концентрации среды, снижение рН среды и введение поликатионов способствует сближению и контакту мембран. Повышение вязкости среды мешает сближению, но облегчает образование контакта уже сближенных мембран. Деформация клеточной поверхности – важный фактор слипания и слияния мембран.
Плотный контакт обеих мембран сначала приводит к образованию пенталаминарной, а затем триламинарной структуры (диафрагмы). Последняя образуется после постепенного вытеснения двух лишних слоев мембран на периферию области контакта. Триламинарная структура – это новый одинарный бислой в зоне контакта, образованный из двух сблизившихся и контактирующих бислоев. Образование триламинарной структуры – универсальный процесс межмембранного взаимодействия.
Добавление ионов Са в малой концентрации в суспензию мембранных везикул вызывает агрегацию, но не слияние последних. При достижении пороговой концентрации Са2+ происходит изотермический фазовый переход фосфолипидов из жидкого состояния в кристаллическое и индуцируется слияние. Ионы Mg повышают температуру фазового перехода фосфолипидов в меньшей степени, чем Са2+. Отсюда следует, что когда Са2+ вызывает слияние везикул, фосфолипиды в присутствии Mg2+ остаются в жидком состоянии и наблюдается агрегация везикул. Это указывает на то, что дестабилизация бислоев при слиянии обусловлена образованием кластеров твердых липидов в жидком бислое.
Структурные перестройки и образование триламинарной структуры могут происходить двумя путями: локально, в зоне «точечного» контакта, в этом случае образуется сталк (перемычка); в зоне плотного дегидратированного контакта (адгезия) на значительной площади мембраны.
Сталкерный механизм предусматривает, что в зоне точечного контакта присутствуют ассиметричные молекулы липидов, участки нестабильности. При контакте эти молекулы хаотически двигаются до тех, пока не образуется триламинарная структура. Адгезионный механизм предусматривает образование в зоне контакта обратных мицелл, сходных гексагональной фазе, в зоне контакта нарушается устойчивость плоской упаковки монослоев, последние преобразуются на обратные мицеллы.
В нормальных условиях слипание и слияние клеток происходит сравнительно редко (в зависимости от функционального состояния клеток). По-видимому, мембранные компоненты различных гранул ответственны за селективную дегрануляцию.
В то время как в нейтрофилах механизмы экзоцитоза не ясны, в нейрональных и дрожжевых клетках механизмы и белковый аппарат секреции изучены довольно детально. Модели слияния мембран, получившей название SNARE гипотеза. Эта гипотеза, впервые предложенная для экзоцитоза синаптических пузырьков, по-видимому ,носит универсальный характер и справедлива как для конститутивного, так и регулируемого слияния мембран.
SNARE гипотеза основана на взаимодействии цитозольных белков NSF (N – ethylmaleimide-sensitive factor) и SNAP (soluble NSF attachment protein) с их рецепторами, названными SNARE (от сочетания английских слов SNAP RECEPTOR). Под термином SNARE традиционно объединяют три группы белков: синтаксисы, синаптобровины/ VAMP (vesicle – associated membrane protein) и SNAP-25 (synaptosome – associated protein of 25 кДа) [45]. Ниже представлена характеристика SNAP, NSF и SNARE, после чего рассмотрен механизм слияния мембран с участием этих белков.
2. Характеристика основных белковых компонентов модели2.1. VAMP/ синаптобревинСемейство VAMP/ синаптобревинов объединяет интегральные мембранные белки с молекулярной массой порядка 18 кДа. Два представителя этого семейства VAMP-1 (синаптобревин 1) и VAMP-2 (синаптобревин 2) впервые были обнаружены и охарактеризованы в везикулах нейтральных клеток [9]. Белки представляют собой продукты двух отдельных генов, экспрессия которых различным образом регулируется в нейронах [30]. В настоящее время ненейрональные гомологи VAMP-1 и VAMP-2 идентифицированы в самых разных эукариотических клетках [13]. Одна из изоформ VAMP, а именно VAMP-3/ селлюбревин, характерна только для ненейрональных клеток [35].
В молекулярной структуре белков этого семейства можно выделить NН2 – концевой район, обогащенный остатками промена (аспарагина), гидрофильный центральный участок – «кор»-протяженностью в 70 аминокислотных остатков и СООН – концевой мембранный домен. В некоторых белках, в частности VAMP из Aplysia Californica и Drosophila melanogaster, на С-конце молекулы присутствует небольшой домен, обращенный в полость везикулы [20]. Гидрофильный «кор» является довольно консервативным и...