Реферат: Методы получения лейкоцитарного и рекомбинантного интерферона

Интерфероны представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой от 15000 до 21000 дальтон, продуцируемые и секретируемые клетками в ответ на вирусную инфекцию или другие возбудители.

Дата добавления на сайт: 01 ноября 2024

Скачать работу 'Методы получения лейкоцитарного и рекомбинантного интерферона':

Введение
Интерфероны представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой от 15000 до 21000 дальтон, продуцируемые и секретируемые клетками в ответ на вирусную инфекцию или другие возбудители.
Интерфероны (ИФН) — группа аутогенных гликопротеинов, биомеханизм действия которых связан с одновременным противовирусным эффектом - активацией клеточных генов, в результате чего синтезируются белки, ингибирующие синтез вирусной ДНК (РНК) и обладающие иммуномодулирующим эффектом — способностью усиливать экспрессию антигенов на клеточных мембранах и увеличивать активность цитотоксических Т-клеток и естественных киллеров [4].
ИФН подразделяются на два типа. К первому типу, действующему как ингибиторы репликации вируса и оказывающему преимущественно противовирусный эффект, относятся 22 различных подтипа ИФН-б и один подтип ИФН-в. Ко второму типу, проявляющему иммуномодуляторную активность, относятся ИФН-г.
Существует три иммунологически различных класса ИФН: ИФН-б, ИФН-в, ИФН-г.
К ИФН естественного происхождения относятся лимфобластоидный и лейкоцитарный ИФН (ИФН-б), синтезируемые соответственно стимулированными моноцитами и В-лимфоцитами человека, которые затем экстрагируются и очищаются; фибробластный ИФН (ИФН-в), получаемый из культуры фибробластов человека, и Т-лимфоцитарный ИФН (ИФН-г).
К искусственно синтезируемым ИФН относится рекомбинантный ИФН-б, который представляет собой высокоочищенный единственный подтип ИФН-б, получаемый по рекомбинантной молекулярной технологии

1. Теоретическая часть
1.1 История открытия интерферонов
С инфекционными болезнями, вызываемыми бактериями, медицина уже до известной степени научилась справляться при помощи антибиотиков, сульфонамидов и других препаратов. Но при заболеваниях, вызываемых вирусами, положение иное, хотя уже в то время, когда еще не было и речи ни о бактериях, ни о вирусах, против одного из опаснейших вирусных, как потом выяснилось, заболеваний, а именно оспы, была предложена вполне действенная предохранительная прививка.
Успешная борьба с детским параличом, которая велась в последнее время, показала, что болезни вирусного происхождения не являются непобедимыми. Изучение вирусов привело в последние годы к открытию, которому суждено большое будущее. Речь идет об интерфероне.
Приведем историю интерферона. Еще в 1935 году ученый Маграсси, изучая на кроликах вирус, вызывающий лихорадку, при которой на губах образуются пузырьки (герпес), обратил внимание на одно странное на первый взгляд обстоятельство. Он вводил кроликам в глаз культуру вируса и через несколько дней обнаруживал этот вирус в мозге у подопытных животных. Когда он вводил этим кроликам через 4 дня в мозг культуру вируса, вызывающего во всех ста процентах случаев смертельное воспаление мозга, на кролика с вирусом герпеса это не действовало. Он как бы не допускал вирус в мозг, подавлял его действие и тем предохранял от болезни. Так вот, подавление действия одного вируса другим при смешанной инфекции и было названо интерференцией вирусов. Через 22 года поисков и исследований учеными многих стран двум американцам — Айзексу и Линдеману удалось частично раскрыть это загадочное явление и направить исследования на путь практического эксперимента, который может привести и к лечению вирусных болезней человека. Айзеке и Линдеман сообщили об этом в лондонском медицинском журнале. Эти ученые заражали куриные зародыши вирусами инфлюэнцы, которые размножаются в яйцевых оболочках зародыша. Но для опыта они брали не живые, а умерщвленные, инактивированные вирусы инфлюэнцы. Затем заражали эти куриные зародыши живыми, активными вирусами, но неудачно. Это наблюдается не только при пользовании вирусами инфлюэнцы и яйцевыми оболочками куриного зародыша. Такое же явление можно отметить при свинке, кори, герпесе и не только при использовании яйцевых оболочек куриного зародыша, но и на тканях щитовидной железы, почечных клетках человека и так далее.
Хотя опыт и напоминает нам предохранительную прививку, например, против оспы, все-таки вопрос в целом еще был весьма неясен, и оба исследователя продолжали свою работу. Они доказали, что в жидкую часть культуры, в которой размножаются клетки, переходит какое-то вещество. Оно и вызывает явление интерференции, почему Айзеке и Линдеман и называли его интерфероном.
После того как интерферон появится в жидкой части культуры, можно заставить его действовать и на другие клетки; последние тогда оказываются предохраненными от соответствующей вирусной инфекционной болезни.
Любопытно, что интерферон не специфичен. Полученный, например, при помощи вирусов инфлюэнцы, он действует так же и при оспе, но, по-видимому, особенно хорошо тогда, когда применяется на том же виде животного, на каком был получен.
Можно полагать, открытие интерферона будет особенно ценным для практической медицины. В настоящее время ставится вопрос о возможности получения интерферона в более сильной концентрации. Если в этом направлении будут достигнуты успехи, со временем начнется причинное лечение вирусных заболеваний. [4,15,25]

1.2 Характеристика и классификация интерферонов
Интерфероны — общее название, под которым в настоящее время объединяют ряд белков со сходными свойствами, выделяемых клетками организма в ответ на вторжение вируса. Благодаря интерферонам клетки становятся невосприимчивыми по отношению к вирусу. «Определяемый в качестве интерферона фактор должен быть белковой природы, обладать антивирусной активностью по отношению к разным вирусам, по крайней мере, в гомологичных клетках, опосредованной клеточными метаболическими процессами, включающими синтез РНК и белка»
Эффекты интерферона
Обладает активируемым действием – интерферон не действует на внеклеточный вирус, а противодействует вирусной инфекции путем усиления фагоцитоза, активизации естественных киллерных клеток, стимулирует образование интерлейкина-2, увеличивает синтез ферментов.
Ингибирование клеточного роста – Как противоопухолевое средств – способен подавлять деление онкогенных клеток при сохранении функции актвации всех звеньев иммунной системы.
Обладает антимикробной активностью
Оказывает радиозащитное действие
Интерферон является иммуномодулятором – стимулирует иммунную систему организма.
Эффекты интерферона (таблица 1)
Обладает антивирусным действием. Самостоятельно интерферон не уничтожает вирусы. После проникновения в клетку вируса начинает синтезироваться интерферон, который выходит за пределы клетки и прикрепляется к поверхности гликозидных рецепторов клеток, пораженных вирусами или клеток, в которых вирус еще не проник. Гликозидные рецепторы способен передавать внутрь клеток сигналы, запускающие механизм синтеза ферментов – эндонуклеазы и протеиназы. Эндонуклиаза способна «разрезать» молекулы нуклеиновых кислот вирусов на уровне трансляции
Интерферон вызывает ингибирование клеточного роста (используется как противоопухолевое средство) – способен подавлять деление онкогенных клеток при сохранении функции активации всех звеньев иммунной системы.
Интерферон оказывает стимулирующее влияние на фагоцитоз, естественные клетки – киллеры и макрофаги; повышает неспецифическую резастентность клеток; а общая иммунологическая реактивность организма адекватна уровню интерферонообразования.
Интерферон обладает антимикробной активностью
Оказывает радиозащитное действие
Интерерон является иммуномодулятором – т. е. регулирует иммунологические реакции, стимулирует иммунную систему организма.
Интерферон относится к протеинам или гликопротеинам, в состав которых включено 146-166 аминокислотных остатков. Молекулярная масса – 20-80 кДальтон. Вырабатывать интерферон могут клетки позвоночных от рыб до человека. наиболее активными продуцентами интерферона являются лимфоциты и макрофаги. Наиболее активными индукторами среди вирусов являются вирус Ньюкаслской болезни, вирус Сендай, чумы свиней.
Выделяют три класса интерферона
Лейкоцитарный или б-IFN-получают в культуре лейкоцитов выделенных из крови доноров. Различают 20 рекомбинантных вариантов, отличающихся последовательностью аминокислот в полепептидной цепи и биологической активностью.
Фибробластный или в-IFN-для получения используют культуру фибрабластов.
Иммунный или г-IFN - его синтезируют сенсебилизированные Т-лимфоциты при повторном контакте с митогенами, а также с бактериальными и вирусными антигенами.
Все три класса интерферонов обладают различными физико-химическими свойствами и отличаются друг от друга серологически.
Различают следующие виды интерферонизации:
Экзогенная – введение готового интерферона в организм, использование мазей, содержащих интерферон.
Эндогенная – введение в организм индукторов интерферон, которые стимулируют процесс образования интерферона.
Наиболее активными индукторами интерферона являются синтетические и природные двунитевые РНК.
Таблица 1 – Влияние интерферона на иммунный ответ и функции клеток
Положительный эффект (стимуляция) Отрицательный эффект (угнетение)
Резистентность клеток к вирусному инфицированию Анафилактическая реакция
Фагоцитоз Гиперчувствительность замедленного типа
Активность натуральных киллеров (НК) Пролиферация лимфоцитов
Экспрессия антигенов главного комплекса гистосовместимости (MHC) Рост клеток (в том числе и опухолевых)
Продукция интерферона ("прайминг") Реакция на трансплантант
Чувствительность к токсическому действию поли I: Реакция трансплантанта против хозяина
Активность лимфоцитов, ответственных за зависимую от антител цитотоксичность Реакция связывания комплемента
Активность цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) Продукция интерферона("блокинг")
Сенсибилизация к антигенам
Образование антител
1.3 Механизм действия интерферонов
Наиболее изученным свойством интерферона является его способность препятствовать размножению вирусов. Он образуется в клетках млекопитающих и птиц в ответ на вирусную инфекцию.При заражении клетки вирус начинает размножаться. Клетка-хозяин одновременно с этим начинает продукцию интерферона, который выходит из клетки и вступает в контакт с соседними клетками. Хотя интерферон не обладает прямым противовирусным действием, он способен вызывать такие изменения в клетках, которые препятствуют размножению вируса, формированию вирусных частиц и дальнейшему его распространению. Интерферон действует в нескольких направлениях. Во-первых, он оказывает влияние на клетки, соседние с инфицированной, запуская в них цепь событий, приводящих к подавлению синтеза вирусных белков и в некоторых случаях сборки и выхода вирусных частиц (путём активации олигоаденилатциклазы). В ответ на воздействие интерферона клетки вырабатывают большое количество протеинкиназы R. Этот фермент фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF-2, фосфорилированный eIF-2 формирует неактивный комплекс с другим фактором, eIF-2B. В результате уровень белкового синтеза в клетке снижается. После протеинкиназы R активируется синтез рибонуклеазы L, которая расщепляет клеточные РНК и ещё больше снижает уровень белкового синтеза. В целом, интерферон-зависимое подавление трансляции является губительным как для вируса, так и для клетки-хозяина. Помимо влияния на трансляцию, интерфероны способны активировать сотни других генов (они известны как гены, стимулируемые интерфероном), играющих роль в защите клетки от вирусов[2][3]. Кроме того, интерферон лимитирует распространение вирусных частиц путём активации белка p53, что ведёт к апоптотической смерти инфицированной клетки.
Вторым направлением действия интерферонов является стимуляция иммунной системы для борьбы с вирусами. Интерферон повышает синтез молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов и активирует иммунопротеасому. Высокий уровень молекул главного комплекса гистосовместимости I класса обеспечивает эффективную презентацию вирусных пептидов цитотоксическим Т-лимфоцитам и натуральным киллерам, а иммунопротеасома осуществляет процессинг вирусных пептидов, предшествующий презентации. Высокий уровень молекул главного комплекса гистосовместимости II класса обеспечивает презентацию вирусных антигенов Т-хелперам. Т-хелперы, в свою очередь, выделяют цитокины, которые координируют активность других клеток иммунной системы. Некоторые виды интерферонов, например интерферон-г, могут прямо стимулировать клетки иммунной системы, такие как макрофаги и натуральные киллеры. Образование интерферона могут стимулировать не только интактные вирусы, но и различные другие агенты, например некоторые инактивированные вирусы, двухцепочечные РНК, синтетические двухцепочечные олигонуклеотиды и бактериальные эндотоксины.
Биологическая активность интерферона очень высока. У мышиного интерферона она составляет 2·109 ед./мг., а одна единица снижает образование вирусов примерно на 50 %. Это означает, что достаточно одной молекулы интерферона, чтобы сделать клетку резистентной к вирусной инфекции. Показано, что молекулы интерферона должны оказывать действие на клетку в течение минимум четырех часов, для того, чтобы в клетке начались процессы борьбы с вирусом, таким образом, многие специалисты не считают эффективным интраназальное применение интерферона для профилактики ОРВИ. Тем не менее, последние исследования показывают, что интерферон, примененный на слизистую оболочку, может действовать в качестве иммунологического адъюванта против вируса гриппа, усиливая специфический ответ иммунной системы. В США проводятся клинические испытания вакцины против гриппа, которая использует интерферон в качестве адъюванта.
Интерферон вызывает и целый ряд других биологических эффектов, в том числе подавляет размножение клеток. Недавние исследования показали, что в определённых условиях он может препятствовать развитию злокачественных новообразований. Установлено также, что интерферон действует на иммунную систему и вызывает изменение клеточных мембран. Таким образом, интерфероновая система, вероятно, может играть важную роль в защите организма от вирусов.
Интерфероны проявляют некоторые виды активности как лимфокины и им-муномодуляторы. Интерфероны I типа, действующие преимущественно как ингибиторы репликации вирусов в клетке, реализуют свой эффект, стимулируя выработку рибосомами клеток хозяина клеточных ферментов, которые тормозят продукцию вирусов, нарушая трансляцию вирусной мРНК и синтез вирусных белков.
Интерфероны вырабатывают большинство видов животных, но проявление их активности видоспецифично, т.е. они действуют только у того вида животных, в которых вырабатываются.
Интерфероны вызывают индукцию трех ферментов:
протеинкиназы, нарушающей начальный этап построения пептидной цепи;
олигоизоаденилат синтетазы, активирующей РНК-азу, которая разрушает вирусную РНК;
фосфодиэстеразы, разрушающей конечные нуклеотиды тРНК, что приводит к нарушению элонгации пептида.
С учетом антивирусного и иммуномоделирующего эффектов интерферонов в НПО «Биомед» предложены и успешно апробированы, суппозитории с интерфероном аn1 и пробиотиками при терапии дисбактериозов вирусной и бактериальной этиологии, кандидозов; в гинекологической практике для лечения эндометритов, кольпитов, вагинитов и гинекологического герпеса. [27, 29, 30]
1.4 Особенности получения интерферонов
Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами.
Основным недостатком этих способов получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др.
В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.
В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.
Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.
Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli.
Известно большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т.13, №9, с.1186-1193), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.
Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.
Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.
Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 (RU 2054041).
Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного...

Похожие материалы:

Реферат: Методы лечения в травматологии и ортопедии

Реферат: Средства и методы развития речи детей дошкольного возраста с задержкой психического развития

Реферат: Новые методы иммунодиагностики и критерии их оценки

Реферат: Физические методы лечения в комплексной терапии повреждений сухожилий и периартикулярных тканей

Реферат: Гистологические методы исследования