Ответы на вопросы: Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней: бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологический, аллергический, собственно иммунный

Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней : бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологический , аллергический, собственно иммунный. Их достоинства и недостатки.

Дата добавления на сайт: 04 марта 2024

Скачать работу 'Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней: бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологический, аллергический, собственно иммунный':

Вопрос 1. Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней : бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологический , аллергический, собственно иммунный. Их достоинства и недостатки.
Бактериоскопический метод-(микроскопический).
Цель: обнаружение микроба возбудителя в патологическом материале больного путем микроскопии.
Этапы:
1.Готовим мазки из патологического материала.
2.Окраска простыми и сложными методами и идентификация возбудителя по морфологическим и тинкториальным свойствам. Этого не достаточно в большинстве случаев, потому что по этим свойствам многие бактерии сходны друг с другом.
«-» малая информативность , малая чувствительность (т к должно быть не менее 100000 в 1 мл), не используется в качестве самостоятельного вида диагностики.
«+» быстрота, простота, дешевизна.
Бактериологический метод-
Цель: выделить микроб возбудитель в чистой культуре и идентифицировать его по совокупности многих биологических свойств.
Этапы:
1.Выделение чистой культуры.
Микроскопия окрашенного препарата по Грамму.Получение отдельных изолированных колоний. Для этого патологический материал больного засеивают на элективные твердые питательные среды методом механического разобщения, чтобы получить изолированные колонии.(описание макро и микроскопических признаков колоний.
2.Накопление чистой культуры. Для этого из подозрительных колоний делаем высев на скошенный агар.
3.Приготовить мазки окрасить по Грамму. Сделать посев на дифференциально диагностическую среду. Идентификация по морфологическим , тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным, фаголизабельным факторам патогенности.
«+» Высокая информативность, высокая чувствительность, 1000 микробных клеток в 1 мл. Возможно определить чувствительность бактерий к антибиотикам и антисептикам.
Биологический метод-
Биологический метод состоит в заражении различным материалом (клиническим, лабораторным) лабораторных животных для индикации возбудителя, а также для определения некоторых свойств микроорганизмов, характеризующих их патогенность (токсигенность, токсичность, вирулентность). В качестве лабораторных животных используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов и др.
Воспроизведение заболевания у животного — абсолютное доказательство патогенности выделенного микроорганизма (в случае бешенства, столбняка и др.). Поэтому биологическая проба на животных является ценным и достоверным диагностическим методом, особенно при тех инфекциях, возбудители которых в исследуемых биологических средах организма человека содержатся в малых концентрациях и плохо или медленно растут на искусственных средах.
Серологический метод-
это обнаружение антител к определенному антигену в сыворотке
больного и определение их титра. Используются серологические
реакции: реакция агглютинации (РА), реакция непрямой
гемагглютинации (РНГА), реакция связывания комплемента (РСК), и др.
Существует два способа подтверждения диагноза заболевания
серологическим методом: 1 – определения наличия антител вдиагностическом титре; 2 – определение природы антител. По природе
антитела могут быть: инфекционные, прививочные,
анамнестические. Природу антител определяют при исследовании
парных сывороток. Парные сыворотки – это две сыворотки, взятые у
больного с интервалом в 5-10 дней. Титр инфекционных антител впарных сыворотках возрастает в 4 раза и более, что подтверждает
клинический диагноз заболевания. Титр анамнестических и
прививочных антител в парных сыворотках не меняется или меняется
незначительно. Для обнаружения антител необходимы известныеантигены. Диагностические препараты, содержащие антитела и
используемые для серологической диагностики, называютсядиагностикумы. Диагностикумы могут содержать взвесь убитых
микробов, отдельные антигены микробов, эритроциты с нагруженнымна их поверхность антигеном (эритроцитарные диагностикумы).
Реакция агглютинации – склеивание корпускулярных антигенов поддействием антител в присутствии электролита. Реакция агглютинации
используется для идентификации бактерий по антигенной структуре, вэтом случае она ставится на предметном стекле (ориентировочнаяреакция), для идентификации бактерий по антигенной структуре
необходимы диагностические агглютинирующие сыворотки.
Диагностические сыворотки – это сыворотки крови кроликов,
иммунизированных определенными микробными антигенами.
Реакция агглютинации используется также для определения титра и
природы антител в серологическом методе диагностики. В этом случае
ставится развернутая РА с использованием диагностикумов.
Нагрузочные реакции иммунитета – реакции, в которых антиген
нагружается на какой-либо носитель. В качестве носителя антигена
используются эритроциты (РНГА), частицы латекса (латекснаяагглютинация), убитые микробные клетки (коагглютинация), частицы
активированного угля (угольная конгламерация).
Реакция Кумбса. Реакция Кумбса используется для определения
неполных антител. Неполные антитела – антитела с одним активным
центром (одновалентные антитела), они не дают видимых реакций привзаимодействии с антигеном. В реакции Кумбса используется
антиглобулиновая сыворотка (АГС), с помощью которой можно увидеть
результат реакции по выявлению неполных антител.
Аллергический-
аллергический   метод  направлен на выявление повышенной чувствительности организма к специфическому аллергену, которым является возбудитель заболевания. Примером этого метода является постановка кожно-аллергических проб. В основе метода лежит феномен гиперчувствительности замедленного типа. Аллергические диагностические пробы — диагностические реакции, выявляющие состояние повышенной чувствительности организма к соответствующим аллергенам.Сенсибилизированный организм отвечает на введение аллергена необычной реакцией местного или общего характера, степень которой определяется видовыми и индивидуальными свойствами организма, особенностями аллергена и способами его введения (см. Аллергия, Анафилаксия). Аллергическое состояние возникает при ряде инфекционных заболеваний (туберкулез, бруцеллез, пневмококковая пневмония, сап, токсоплазмоз и др.), однако практическое применение аллергические диагностические пробы получили при ограниченном числе заболеваний. Диагностическая ценность А. д. п. определяется их специфичностью, чувствительностью и безопасностью для человека или животного. Аллергическое состояние возникает через некоторое время после начала инфекции, что необходимо учитывать при постановке А. д. п. Диагностическая ценность А. д. п. заключается в том, что с их помощью удается выявить атипичные и хронические случаи заболеваний, когда установление диагноза по клиническими микробиологическим данным затруднительно. Так как аллергическое состояние организма сохраняется в течение длительного срока после перенесенного заболевания, то А. д. п. могут быть использованы также для постановки ретроспективного диагноза.
Собственно иммунный- Цель метода – индикация и
идентификация антигенов возбудителя в исследуемом материале.
Используются РП, РИФ, ИФА, РСК. Собственно иммунный метод – это
экспресс-диагностика, результат исследования получается в течение
нескольких часов или одних суток.
Реакция преципитации – это осаждение мелкодисперсного растворимого
антигена под действием антител в присутствии электролита. Реакция очень
чувствительна в отношении антигена, она позволяет обнаруживать и
идентифицировать буквально следы антигена. Варианты постановки: реакция
кольцепреципитации, реакция преципитации в геле (агаре). Модификации
РП: иммуноэлектрофорез, радиальная иммунодиффузия по Манчини,
иммуноблотинг. Реакция преципитации применяется для индикации и
идентификации антигена в исследуемом материале. РП получила
распространение в судебно-медицинской экспертизе, используется дляопределения принадлежности пятен биологических жидкостей по видовой
принадлежности белка. РП в агаре используется для определения
токсигенности культур микроорганизмов (при диагностике дифтерии,стафилококкового токсикоза). Метод радиальной иммунодиффузии по
Манчини используется для определения разных классов иммуноглобулинов всыворотке крови. Иммуноэлектрофорез используется для определения
белковых фракций сыворотки крови.
Преципитирующие сыворотки получают иммунизацией кроликов антигенами
бактерий, их экстрактами и токсинами. Титром преципитирующей сыворотки
называется то максимальное разведение антигена, при котором идет реакция
преципитации. Преципитирующие сыворотки выпускаются с высокимтитром - не менее 1:100000. Это связано с тем, что антиген, определяемый вреакции преципитации, имеет мелкодисперсную структуру и в единице
объема его может содержаться больше, чем в таком же объеме сыворотки -
антител.
Специфические преципитирующие сыворотки применяются при диагностике
инфекционных заболеваний (сибирская язва, чума, туляремия, дифтерия, идр.), в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой
принадлежности белка, в санитарной практике для обнаружения соответствия
белковых веществ в продуктах (при подозрении на фальсификацию).
Реакция нейтрализации – способность антител нейтрализовать токсины,
вирусы, яды змей. Используется для индикации и идентификации токсинов,
для идентификации вирусов, и др. РН не дает видимого результата in vitro,
поэтому она учитывается по биопробе на животных или в культуре ткани. РН
in vivo может быть использована для определения степени напряженности
антитоксического иммунитета в организме человека (пробаШика).
Реакция флоккуляции (РФ) - используется для титрования
антитоксических сывороток, токсинов и анатоксинов. В реакции
флоккуляции в качестве антигена участвует токсин или анатоксин. При
смешивании их в эквивалентных соотношениях с антитоксическойсывороткой появляется помутнение, а затем рыхлый осадок. Механизм РФ
сходен с таковым реакции преципитации.
В реакциях нейтрализации и флоккуляции участвуют в качестве компонентов
токсины, анатоксины, антитоксины (антитоксические сыворотки).
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Разработана А. Кунсом и носит
его имя (метод Кунса). Это один из методов исследования, в котором
используются меченные антитела. В качестве метки используется краситель,
дающий свечение в ультрафиолетовых лучах (изоцианат флюоресцеина илипросто флюорохром). Риф используется в двух модификациях: прямой
метод Кунса и непрямой метод Кунса. Прямой метод: исследуемый
материал, зафиксированный на предметном стекле, обрабатывается меченойфлюорохромом диагностической сывороткой; обязательный этап реакции –
отмывка от непрореагировавших антител; если в исследуемом материале есть
искомый антиген, меченные антитела фиксируются на антигене и после
отмывки такой комплекс выявляется по свечению при просматривании
препарата под люминесцентным микроскопом. Непрямой метод: в этом
случае реакция идет в два этапа – на первом этапе используется немеченая
диагностическая сыворотка, на втором этапе используется меченая
флюорохромом антиглобулиновая сыворотка; с помощью непрямого метода
можно выявлять в исследуемом материале как наличие антигена, так и
наличие и титр специфических антител.
Люминесцирующие (флюоресцирующие) сыворотки представляют собой
иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, меченые
флюоресцирующими красителями. При приготовлении люминесцирующихсывороток проводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной
сыворотки флюорохромов путем прочной химической связи. Люминесцирующие сыворотки используют при постановке РИФ.
Антиглобулиновые сыворотки (АГС) содержат антитела к иммуног-
лобулинам сыворотки человека или кролика - в зависимости оттого, какая
иммунная сыворотка используется в реакции. АГС получают путем
иммунизации животных иммуноглобулинами человека или кролика. Такие
сыворотки используют для постановки непрямой РИФ, реакции ИФА, реак-
ции Кумбса.
РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для;1) серологической диагностики инфекционных заболеваний 2) идентификации бактерии и др. микробов.РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ- АТ-, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.
РСК проводится в два этапа при участии двух систем:1) Первая система — АГ+АТ-(-комплемент — обуславливает связывание комплемента в том случае, если АТ соответствует АГ, В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным;2) Вторая система (индикаторная) — гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты — показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т.к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент.
Компоненты реакции:1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 «С в течение 30 минут);2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов);3) комплемент;4) гемолитическая сыворотка;5) 3 % взвесь эритроцитов барана,6) физиологический раствор;7) контрольная сыворотка.
Комплемент, В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.
Титр комплемента — наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.
Рабочая доза комплемента — количество комплемента, которое выше тира на 25 %.
Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50 % взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 °С. Определяют титр и рабочую дозу.
Титр сыворотки — максимальное разведение сыворотки, которая вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) во многом напоминает РИА, но включает использование коммерческих реагентов — Аг или AT, маркированных ферментами (например, пероксидазой или щелочной фосфатазой). После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к окрашиванию среды в жёлто-коричневый (при использовании псроксидазы) или жёлто-зелёный цвет (при использовании фосфатазы).
По сравнению с классическими методами выявления Аг, иммуноферментный анализ ( ифа ) позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие Аг с AT в специфической фазе, а не анализировать вторичные проявления взаимодействия — агглютинацию, преципитацию или гемолиз. Метод отличает высокая чувствительность — обычно достаточно присутствия Аг в концентрации I нг/мл. К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики.
Наибольшее распространение получил гетерогенный иммуноферментный анализ ( ифа ) на твёрдой фазе (твердофазный ИФА). Для этого коммерческие моноклональные AT или Аг фиксируют на лунках пластиковых панелей, куда затем вносят исследуемый материал (содержащий Аг или AT).