Ответы на вопросы: Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней: бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологический, аллергический, собственно иммунный
Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней : бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологический , аллергический, собственно иммунный. Их достоинства и недостатки.
Дата добавления на сайт: 04 марта 2024
Вопрос 1. Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней : бактериоскопический, бактериологический, биологический, серологический , аллергический, собственно иммунный. Их достоинства и недостатки.
Бактериоскопический метод-(микроскопический).
Цель: обнаружение микроба возбудителя в патологическом материале больного путем микроскопии.
Этапы:
1.Готовим мазки из патологического материала.
2.Окраска простыми и сложными методами и идентификация возбудителя по морфологическим и тинкториальным свойствам. Этого не достаточно в большинстве случаев, потому что по этим свойствам многие бактерии сходны друг с другом.
«-» малая информативность , малая чувствительность (т к должно быть не менее 100000 в 1 мл), не используется в качестве самостоятельного вида диагностики.
«+» быстрота, простота, дешевизна.
Бактериологический метод-
Цель: выделить микроб возбудитель в чистой культуре и идентифицировать его по совокупности многих биологических свойств.
Этапы:
1.Выделение чистой культуры.
Микроскопия окрашенного препарата по Грамму.Получение отдельных изолированных колоний. Для этого патологический материал больного засеивают на элективные твердые питательные среды методом механического разобщения, чтобы получить изолированные колонии.(описание макро и микроскопических признаков колоний.
2.Накопление чистой культуры. Для этого из подозрительных колоний делаем высев на скошенный агар.
3.Приготовить мазки окрасить по Грамму. Сделать посев на дифференциально диагностическую среду. Идентификация по морфологическим , тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным, фаголизабельным факторам патогенности.
«+» Высокая информативность, высокая чувствительность, 1000 микробных клеток в 1 мл. Возможно определить чувствительность бактерий к антибиотикам и антисептикам.
Биологический метод-
Биологический метод состоит в заражении различным материалом (клиническим, лабораторным) лабораторных животных для индикации возбудителя, а также для определения некоторых свойств микроорганизмов, характеризующих их патогенность (токсигенность, токсичность, вирулентность). В качестве лабораторных животных используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов и др.
Воспроизведение заболевания у животного — абсолютное доказательство патогенности выделенного микроорганизма (в случае бешенства, столбняка и др.). Поэтому биологическая проба на животных является ценным и достоверным диагностическим методом, особенно при тех инфекциях, возбудители которых в исследуемых биологических средах организма человека содержатся в малых концентрациях и плохо или медленно растут на искусственных средах.
Серологический метод-
это обнаружение антител к определенному антигену в сыворотке
больного и определение их титра. Используются серологические
реакции: реакция агглютинации (РА), реакция непрямой
гемагглютинации (РНГА), реакция связывания комплемента (РСК), и др.
Существует два способа подтверждения диагноза заболевания
серологическим методом: 1 – определения наличия антител в
диагностическом титре; 2 – определение природы антител. По природе
антитела могут быть: инфекционные, прививочные,
анамнестические. Природу антител определяют при исследовании
парных сывороток. Парные сыворотки – это две сыворотки, взятые у
больного с интервалом в 5-10 дней. Титр инфекционных антител в
парных сыворотках возрастает в 4 раза и более, что подтверждает
клинический диагноз заболевания. Титр анамнестических и
прививочных антител в парных сыворотках не меняется или меняется
незначительно. Для обнаружения антител необходимы известные
антигены. Диагностические препараты, содержащие антитела и
используемые для серологической диагностики, называются
диагностикумы. Диагностикумы могут содержать взвесь убитых
микробов, отдельные антигены микробов, эритроциты с нагруженным
на их поверхность антигеном (эритроцитарные диагностикумы).
Реакция агглютинации – склеивание корпускулярных антигенов под
действием антител в присутствии электролита. Реакция агглютинации
используется для идентификации бактерий по антигенной структуре, в
этом случае она ставится на предметном стекле (ориентировочная
реакция), для идентификации бактерий по антигенной структуре
необходимы диагностические агглютинирующие сыворотки.
Диагностические сыворотки – это сыворотки крови кроликов,
иммунизированных определенными микробными антигенами.
Реакция агглютинации используется также для определения титра и
природы антител в серологическом методе диагностики. В этом случае
ставится развернутая РА с использованием диагностикумов.
Нагрузочные реакции иммунитета – реакции, в которых антиген
нагружается на какой-либо носитель. В качестве носителя антигена
используются эритроциты (РНГА), частицы латекса (латексная
агглютинация), убитые микробные клетки (коагглютинация), частицы
активированного угля (угольная конгламерация).
Реакция Кумбса. Реакция Кумбса используется для определения
неполных антител. Неполные антитела – антитела с одним активным
центром (одновалентные антитела), они не дают видимых реакций при
взаимодействии с антигеном. В реакции Кумбса используется
антиглобулиновая сыворотка (АГС), с помощью которой можно увидеть
результат реакции по выявлению неполных антител.
Аллергический-
аллергический
метод направлен на выявление повышенной чувствительности организма к специфическому аллергену, которым является возбудитель заболевания. Примером этого метода является постановка кожно-аллергических проб. В основе метода лежит феномен гиперчувствительности замедленного типа. Аллергические диагностические пробы — диагностические реакции, выявляющие состояние повышенной чувствительности организма к соответствующим аллергенам.Сенсибилизированный организм отвечает на введение аллергена необычной реакцией местного или общего характера, степень которой определяется видовыми и индивидуальными свойствами организма, особенностями аллергена и способами его введения (см. Аллергия, Анафилаксия). Аллергическое состояние возникает при ряде инфекционных заболеваний (туберкулез, бруцеллез, пневмококковая пневмония, сап, токсоплазмоз и др.), однако практическое применение аллергические диагностические пробы получили при ограниченном числе заболеваний. Диагностическая ценность А. д. п. определяется их специфичностью, чувствительностью и безопасностью для человека или животного. Аллергическое состояние возникает через некоторое время после начала инфекции, что необходимо учитывать при постановке А. д. п. Диагностическая ценность А. д. п. заключается в том, что с их помощью удается выявить атипичные и хронические случаи заболеваний, когда установление диагноза по клиническими микробиологическим данным затруднительно. Так как аллергическое состояние организма сохраняется в течение длительного срока после перенесенного заболевания, то А. д. п. могут быть использованы также для постановки ретроспективного диагноза.
Собственно иммунный- Цель метода – индикация и
идентификация антигенов возбудителя в исследуемом материале.
Используются РП, РИФ, ИФА, РСК. Собственно иммунный метод – это
экспресс-диагностика, результат исследования получается в течение
нескольких часов или одних суток.
Реакция преципитации – это осаждение мелкодисперсного растворимого
антигена под действием антител в присутствии электролита. Реакция очень
чувствительна в отношении антигена, она позволяет обнаруживать и
идентифицировать буквально следы антигена. Варианты постановки: реакция
кольцепреципитации, реакция преципитации в геле (агаре). Модификации
РП: иммуноэлектрофорез, радиальная иммунодиффузия по Манчини,
иммуноблотинг. Реакция преципитации применяется для индикации и
идентификации антигена в исследуемом материале. РП получила
распространение в судебно-медицинской экспертизе, используется для
определения принадлежности пятен биологических жидкостей по видовой
принадлежности белка. РП в агаре используется для определения
токсигенности культур микроорганизмов (при диагностике дифтерии,
стафилококкового токсикоза). Метод радиальной иммунодиффузии по
Манчини используется для определения разных классов иммуноглобулинов в
сыворотке крови. Иммуноэлектрофорез используется для определения
белковых фракций сыворотки крови.
Преципитирующие сыворотки получают иммунизацией кроликов антигенами
бактерий, их экстрактами и токсинами. Титром преципитирующей сыворотки
называется то максимальное разведение антигена, при котором идет реакция
преципитации. Преципитирующие сыворотки выпускаются с высоким
титром - не менее 1:100000. Это связано с тем, что антиген, определяемый в
реакции преципитации, имеет мелкодисперсную структуру и в единице
объема его может содержаться больше, чем в таком же объеме сыворотки -
антител.
Специфические преципитирующие сыворотки применяются при диагностике
инфекционных заболеваний (сибирская язва, чума, туляремия, дифтерия, и
др.), в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой
принадлежности белка, в санитарной практике для обнаружения соответствия
белковых веществ в продуктах (при подозрении на фальсификацию).
Реакция нейтрализации – способность антител нейтрализовать токсины,
вирусы, яды змей. Используется для индикации и идентификации токсинов,
для идентификации вирусов, и др. РН не дает видимого результата in vitro,
поэтому она учитывается по биопробе на животных или в культуре ткани. РН
in vivo может быть использована для определения степени напряженности
антитоксического иммунитета в организме человека (пробаШика).
Реакция флоккуляции (РФ) - используется для титрования
антитоксических сывороток, токсинов и анатоксинов. В реакции
флоккуляции в качестве антигена участвует токсин или анатоксин. При
смешивании их в эквивалентных соотношениях с антитоксической
сывороткой появляется помутнение, а затем рыхлый осадок. Механизм РФ
сходен с таковым реакции преципитации.
В реакциях нейтрализации и флоккуляции участвуют в качестве компонентов
токсины, анатоксины, антитоксины (антитоксические сыворотки).
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Разработана А. Кунсом и носит
его имя (метод Кунса). Это один из методов исследования, в котором
используются меченные антитела. В качестве метки используется краситель,
дающий свечение в ультрафиолетовых лучах (изоцианат флюоресцеина или
просто флюорохром). Риф используется в двух модификациях: прямой
метод Кунса и непрямой метод Кунса. Прямой метод: исследуемый
материал, зафиксированный на предметном стекле, обрабатывается меченой
флюорохромом диагностической сывороткой; обязательный этап реакции –
отмывка от непрореагировавших антител; если в исследуемом материале есть
искомый антиген, меченные антитела фиксируются на антигене и после
отмывки такой комплекс выявляется по свечению при просматривании
препарата под люминесцентным микроскопом. Непрямой метод: в этом
случае реакция идет в два этапа – на первом этапе используется немеченая
диагностическая сыворотка, на втором этапе используется меченая
флюорохромом антиглобулиновая сыворотка; с помощью непрямого метода
можно выявлять в исследуемом материале как наличие антигена, так и
наличие и титр специфических антител.
Люминесцирующие (флюоресцирующие) сыворотки представляют собой
иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, меченые
флюоресцирующими красителями. При приготовлении люминесцирующих
сывороток проводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной
сыворотки флюорохромов путем прочной химической связи. Люминес
цирующие сыворотки используют при постановке РИФ.
Антиглобулиновые сыворотки (АГС) содержат антитела к иммуног-
лобулинам сыворотки человека или кролика - в зависимости оттого, какая
иммунная сыворотка используется в реакции. АГС получают путем
иммунизации животных иммуноглобулинами человека или кролика. Такие
сыворотки используют для постановки непрямой РИФ, реакции ИФА, реак-
ции Кумбса.
РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для;1) серологической диагностики инфекционных заболеваний 2) идентификации бактерии и др. микробов.РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ- АТ-, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.
РСК проводится в два этапа при участии двух систем:1) Первая система — АГ+АТ-(-комплемент — обуславливает связывание комплемента в том случае, если АТ соответствует АГ, В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным;2) Вторая система (индикаторная) — гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты — показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т.к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент.
Компоненты реакции:1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 «С в течение 30 минут);2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов);3) комплемент;4) гемолитическая сыворотка;5) 3 % взвесь эритроцитов барана,6) физиологический раствор;7) контрольная сыворотка.
Комплемент, В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.
Титр комплемента — наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.
Рабочая доза комплемента — количество комплемента, которое выше тира на 25 %.
Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50 % взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 °С. Определяют титр и рабочую дозу.
Титр сыворотки — максимальное разведение сыворотки, которая вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) во многом напоминает РИА, но включает использование коммерческих реагентов — Аг или AT, маркированных ферментами (например, пероксидазой или щелочной фосфатазой). После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к окрашиванию среды в жёлто-коричневый (при использовании псроксидазы) или жёлто-зелёный цвет (при использовании фосфатазы).
По сравнению с классическими методами выявления Аг, иммуноферментный анализ ( ифа ) позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие Аг с AT в специфической фазе, а не анализировать вторичные проявления взаимодействия — агглютинацию, преципитацию или гемолиз. Метод отличает высокая чувствительность — обычно достаточно присутствия Аг в концентрации I нг/мл. К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики.
Наибольшее распространение получил гетерогенный иммуноферментный анализ ( ифа ) на твёрдой фазе (твердофазный ИФА). Для этого коммерческие моноклональные AT или Аг фиксируют на лунках пластиковых панелей, куда затем вносят исследуемый материал (содержащий Аг или AT).