Курсовая работа: Иммуногистохимические изменения в нейронах коры головного мозга при холестазе
Желчь - секрет, выделяемый печеночными клетками, содержащий конъюгированный билирубин, соли желчных кислот, холестерин, фосфолипиды, белки, электролиты, микроэлементы и воду [1].
Дата добавления на сайт: 27 ноября 2024
Иммуногистохимические изменения в нейронах коры головного мозга при холестазе
РЕФЕРАТ
Курсовая работа: 37 страниц, 23 рисунка, 2 таблицы.
Ключевые слова: головной мозг, фронтальная кора, теменная кора, нейроны, структура, цитотохимия, холестаз.
Цель исследования - оценить иммуногистохимические показатели нейронов фронтальной и теменной коры больших полушарий головного мозга в различные сроки подпеченочного холестаза у крыс.
Объект исследования: мозг крыс при холестазе.
Предмет исследования: гистохимические изменения нейронов мозга крыс при холестазе.
Методы и методики исследования:
Для изучения влияния холестаза на различные отделы мозга эксперименты проводились самцах крыс Wistar весом 200 ± 25 г. Все экспериментальные процедуры должны соответствовать Директиве Совета Европейского сообщества (86/609 / EEC) по уходу и использованию лабораторных животных.
Экспериментальных крыс анестезируют этиловым эфиром, а общий желчный проток лигируют на 3-5 мм ниже слияния лобарных протоков, применяя две лигатуры с последующим пересечением между ними. Животные контрольной группы подвергаются фиктивной операции. На 2-й, 5-й, 10-й, 20-й, 45-й и 90-й день животных из группы контроля и из группы с холестазом декапитировали, образцы их мозжечка собирали и фиксировали в цинк-этанол-формалине при 4 ° С (ночь), а затем залили в парафин.
Блоки парафина (7 мкм) разрезали LeicaRM2125 (микротомом RTS, Германия). Иммуногистохимическое обнаружение проводили с использованием поликлональных антител кролика, экспозиции в течение 20 часов во влажной камере. Связывание первичных антител было обнаружено с использованием Thermo Scientific Super Picture ™ Polymer Detection Kit. Связывание первичных антител было обнаружено с использованием контейнера Expose Mouse и Rabbit Specific HRP / DAB IHC Kit ab. 80436 (Abcam, UK).
Для стандартизации исследования во всех образцах была исследована латеральная зона задней доли мозжечковых полушарий. Кора головного мозга этой области двусторонне связана с сенсомоторной корой головного мозга, что позволяет планировать и координировать быстрые движения тела, следующие один за другим. Гистохимические препараты были исследованы, сфотографированы и изучены морфометрически с использованием микроскопа Axioscop 2 plus (Zeiss, Германия) с цифровой видеокамерой LeicaDFC 320 (Leica, Германия) и программой анализа изображений ImageWarp (Bitflow, США).
Средние значения, полученные у животных каждой экспериментальной группы, анализировались непараметрической статистикой (из-за небольшого числа животных в группах) в Statistica 10.0 для Windows (StatSoft, США). Описательная статистика для каждого параметра включала определение медианного (Me) и межквартильного диапазона (IQR). Различия между значениями в контрольной и экспериментальной группах считались значимыми при p День
На 2-й день после лигирования общего желчного протока в молекулярном слое коры мозжечка экспрессия синаптофизина не различалась, на 5-й день он увеличивался на 16%, а на 10-й день - на 38%, по сравнению с контрольной группой. На последующих временных интервалах исследования он не отличался от контрольной группы (рисунок 2.2 B, C, таблица 2.1)
Экспрессия глутаматдекарбоксилазы (GAD67) в цитоплазме клеток Пуркинье была обнаружена (как в телах, так и дендритах), а также вокруг тел клеток Пуркинье. В молекулярном слое также были видны глутаматдекарбоксилаза-иммуноположительные звездчатые и корзиночные клетки, образующие многочисленные аксональные и аксодендритные синапсы на клетках Пуркинье (рисунок 2.2 A, C). В гранулированном слое были обнаружены глутаматдекарбоксилаза-иммуноположительные нейроны, а также терминалы на периферии мозжечковых клубочков (рисунок 2.2 А, В).
Рисунок 2.2 - Экспрессия GAD67 в коре мозжечка крыс[15]:
рисунок 2.2 А, С - контроль (10 дней и 20 дней после фиктивных операций, соответственно);
рисунок 2.2 B - 10 дней;
рисунок 2.2 D - 20 дней холестаза., D-стрелки показывают увеличенные корзины с повышенной иммунореактивностью вокруг тел клеток Пуркинье. Цифровая микрофотография. Шкала шкалы -20 мкм Увеличение x400.
На второй день после лигирования общего желчного протока в цитоплазме клеток Пуркинье экспрессия глутаматдекарбоксилазы уменьшилась на 10% (таблица 2.2). На 5-й день холестаза экспрессия глутаматдекарбоксилазы в цитоплазме остальных клеток Пуркинье увеличилась на 28%. Корзины вокруг перикариона стали более заметными, вытянутыми, удлиненными в направлении гранулированного слоя и проявляли более темное окрашивание из-за увеличения глутаматдекарбоксилазы-иммунореактивности на 11%. На 10-й день холестаза экспрессия глутаматдекарбоксилазы в цитоплазме выживших клеток Пуркинье увеличилась на 41% и в их корзинах на 39%, соответственно, по сравнению с контролем (рисунок 2.2 В, таблица 2.2). Холестаз в течение 20 дней приводил к увеличению экспрессии глутаматдекарбоксилазы в цитоплазме выживших клеток Пуркинье на 61% и увеличению их корзин на 33% по сравнению с контролем (рисунок 2.2 D, таблица 2.2). Однако на 45-й и 90-й день после лигирования общего желчного протока иммуногистохимические различия не определялись по сравнению с контрольными (таблица 2.2)[15].
Таблица 2.2 - Экспрессия глутаматдекарбоксилазы в коре головного мозга крыс (единица оптической плотности × 103[15])
| День | Тела клеток Пуркинье | Область вокруг клеток Пуркинье | ||
| Контроль | Экспериментальная группа | Контроль | Экспериментальная группа | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 2 | 182.12 ± 2.48 | 163.81 ± 4.85 ** | 197.27 ± 11.0 | 188.02 ± 14.42 |
| 5 | 160.54 ± 2.85 | 205.11 ± 5.37 *** | 189.73 ± 16.09 | 211.18 ± 8.75 *** |
| 10 | 166.37 ± 3.92 | 235.04 ± 4.27 *** | 189.72 ± 12.88 | 264.26 ± 18,64 *** |
| 20 | 155.51 ± 3.86 | 250.26 ± 3.88 *** | 189.27 ± 10.12 | 251.16 ± 17.40 *** |
| 45 | 166.37 ± 3.79 | 168.13 ± 4.44 | 188.22 ± 8.70 | 190.02 ± 14.29 |
| 90 | 166.36 ± 3.05 | 165.43 ± 4.13 | 189.73 ± 11.27 | 184.44 ± 16.81 |
Временное увеличение синаптофизина в молекулярном слое мозжечка может отражать усиленный синаптогенез, увеличение количества синаптических пузырьков в синапсах, что является компенсаторной реакцией.
Увеличение экспрессии глутаматдекарбоксилазы вокруг их тел указывает на активацию клеток ГАМК-эргической области, которые могут компенсировать гиперрезистентные клетки Пуркинье, возможно, для поддержки функций мозжечка[8].
ГЛАВА 3. ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В НЕЙРОНАХ ФРОНТАЛЬНОЙ, ТЕМЕННОЙ КОРЫ
.1 Гистохимические изменения в нейронах фронтальной коры крыс
Холестаз в течение 2 суток вызывает только в пятом слое нейронов статистически значимое снижение активности НАДН-ДГ на 15,7 % (Z=3,13; p=0,002); снижение содержания РНК на 8,2 % (Z=3,13; p=0,002), и усиление активности КФ на 17,1 % (Z=-3,13; p=0,002) и ЛДГ на 23,7 % (Z=-2,23; p=0,025).
Пятисуточный подпечёночный холестаз у экспериментальных крыс вызывает статистически достоверное снижение активности СДГ в третьем - на 7,0 % (Z=2,71; p=0,007) и пятом - на 5,2 % (Z=2,36; p=0,018) слоях коры. Активность НАДН-ДГ в третьем слое нейронов уменьшается на 3,9 % (Z=2,71; p=0,007), а активность ЛДГ - повышается на 13,9 % (Z=-2,14; p=0,032).
Десятисуточный подпечёночный холестаз у экспериментальных животных вызывает существенное снижение активности одних ферментов и усиление других. Так, активность СДГ во втором слое фронтальной доли коры больших полушарий снижается на 42,6 % (Z=3,13; p=0,002) (рисунок 3.1)в третьем - на 45,8 % (Z=3,13; p=0,002) и в пятом - на 45,5 % (Z=3,13; p=0,002). Активность НАДН-ДГ у опытных животных во втором слое нейронов снижается на 43,3 % (Z=3,13; p=0,002) (рисунок 3.2), в третьем слое - на 35,4 % (Z=3,13; p=0,002), а в пятом - на 39,1 % (Z=3,13; p=0,002) (рисунок 3.3). Активность Г-6-ФДГ снижается на 17,1 % (Z=3,0; p=0,003), а в третьем и пятом слоях снижение более выраженное и составляет соответственно - 48,0 % (Z=3,13; p=0,002) и 42,3 % (Z=3,13; p=0,002) (рисунок 3.4). Активность кислой фосфатазы возрастает: во втором слое на 39,7 % (Z=-3,13; p=0,002), в третьем - на 79,9 % (Z=-3,13; p=0,002), в пятом - 34,0 % (Z=-3,13; p=0,002) (рисунок 3.5). Активность ЛДГ также усиливается во всех изучаемых слоях коры. Если во втором слое это усиление составляет 27,0 % (Z=-2,11; p=0,035), в третьем - 29,8 % (Z=-2,62; p=0,009) (рисунок 3.6), то в пятом - 29,2 % (Z=-3,13; p=0,002). Содержание РНК уменьшается в цитоплазме нейронов всех изучаемых слоев коры: на 17,3 % (Z=2,11; p=0,035), 15,3 % (Z=3,13; p=0,002) и 21,9 % (Z=3,13; p=0,002) соответственно во 2, 3 и 5 слоях коры фронтальной доли (рисунки 3.7).
Через 45 суток выявлено статистически достоверное повышение активности ферментов в нейронах второго слоя для СДГ - на 6,3 % (Z=-2,75; p=0,006), для КФ - на 11,8 % (Z=-2,36; p=0,018) и снижение активности Г-6-ФДГ на 6,8 % (Z=2,11; p=0,035). В третьем слое отмечено повышение активности КФ на 17,5 % (Z=-3,13; p=0,002) и в пятом слое повышение активности для Г-6-ФДГ на 8,6 % (Z=-2,87; p=0,004)[28].
Через 90 суток после перевязки общего жёлчного протока не выявлено статистически достоверных гистохимических изменений[16].
Рисунок 3.1 - Активность СДГ в нейронах 2 слоя фронтальной коры[ 16]: активность СДГ в нейронах 2 слоя фронтальной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Нахласу и др. Ув. 200. Цифровая микрофотография.
Рисунок 3.2 - активность НАДН-ДГ в нейронах 2 слоя фронтальной коры[16]: активность НАДН-ДГ в нейронах 2 слоя фронтальной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Нахласу, Уокеру, Зелигману. Ув. 800. Цифровая микрофотография.
Рисунок 3.3 - Активность НАДН-ДГ в нейронах 5 слоя фронтальной коры[16]: Активность НАДН-ДГ в нейронах 5 слоя фронтальной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Нахласу, Уокеру, Зелигману.
Рисунок 3.4 - активность Г-6-ФДГ в нейронах 5 слоя фронтальной коры[16]: активность Г-6-ФДГ в нейронах 5 слоя фронтальной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Гесс, Скарпели, Пирсу. Ув. 400. Цифровая микрофотография.
Рисунок 3.5 - Активность КФ в нейронах 5 слоя фронтальной коры[16]: активность КФ в нейронах 5 слоя фронтальной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Гомори. Ув. 1200. Цифровая микрофотография.
Рисунок 3.6 - Активность КФ в нейронах 5 слоя фронтальной коры[16]: активность ЛДГ в нейронах 3 слоя фронтальной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Гесс, Скарпели, Пирсу. Ув. 1200. Цифровая микрофотография.
Рисунок 3.7 - Содержание РНК в нейронах 3 слоя фронтальной коры[16]: содержание РНК в нейронах 3 слоя фронтальной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Эйнарсону. Ув. 1200. Цифровая микрофотография.
Таким образом все вышесказаное свидетельствует о тяжелых морфо-функциональных нарушениях во фронтальной коре мозга при холестазе у крыс, что приводит к гибели части её нейронов. С другой стороны, в сохранившихся нейронах развиваются значительные адаптационные изменения, ведущие к восстановлению структуры и метаболизма нейронов в отдалённые сроки после устранения холестаза[28].
.2 Гистохимические изменения в нейронах теменной коры крыс
Холестаз в течение 2 суток приводит к изменению активности ферментов: во втором слое нейронов активность ЛДГ увеличивается на 15,8 % (Z=-2,36; p=0,018); в 3 слое снижается: СДГ - на 3,2 % (Z=1,98; p=0,048), НАДН-ДГ - на 6,8 % (Z=2,87; p=0,025), Г-6-ФДГ - на 5,9 % (Z=2,36; p=0,018) и содержание РНК - на 4,5 % (Z=2,24; p=0,025); в 5 слое активность КФ повышается на 3,0 % (Z=-2,62; p=0,009).
После 5-суточного холестаза происходит статистически значимое снижение активности оксидоредуктаз: СДГ снижается во 2 слое на 8,4 % (Z=2,43; p=0,015); активность НАДН-ДГ во 2 слое снижается на 19,1 % (Z=3,0; p=0,003) и в 3 - на 9,7 % (Z=2,57; p=0,01); активность Г-6-ФДГ в клетках 3 слоя снижается на 9,7 % (Z=2,86; p=0,004). Активность КФ во 2 и 5 слоях повышается на 11,9 % (Z=-2,29; p=0,022) и 16,1 % (Z=-2,57; p=0,01) соответственно. ЛДГ также повышается во 2 слое на 15,9 % (Z=-3,0; p=0,003) и в 5 - на 13,6 % (Z=-3,0; p=0,003).
Холестаз в течение 10 суток приводит к снижению активности оксидоредуктаз в теменной доле коры больших полушарий головного мозга. В частности, активность СДГ снижается во втором слое на 37,8 % (Z=2,36; p=0,018), в третьем - на 48,7 % (Z=3,13; p=0,002) и в пятом - на 45,7 % (Z=3,13; p=0,002) (рисунки 6.18, 6.19). Активность НАДН-ДГ у опытных крыс во втором слое клеток уменьшается на 30,9 % (Z=3,13; p=0,002) от исходных контрольных значений. Нейроны третьего слоя имеют ту же закономерность: здесь в опыте активность снижена на 8,6 % (Z=2,36; p=0,018) от контрольных данных.
В пятом слое клеток снижение активности не такое значительное: в опыте активность уменьшается на 5,8 % (Z=2,75; p=0,006) от контрольных значений (рисунки 6.20, 6.21, 6.22). Г-6-ФДГ во всех изученных слоях также имеет тенденцию к снижению в опыте: на 33,9 % (Z=3,13; p=0,002), 14,8 % (Z=3,13; p=0,002) и 36,1 % (Z=3,13; p=0,002) соответственно во 2, 3 и 5 слоях коры больших полушарий (рисунок 3.8). Кислая фосфатаза после десятисуточного холестаза активизируется во всех изученных структурах: во втором слое - на 7,1 % (Z=-2,87; p=0,004), в третьем слое - на 51,0 % (Z=-3,13; p=0,002), в пятом слое - на 29,3 % (Z=-3,13; p=0,002) по сравнению с контрольными данными (рисунок 3.9). Активность ЛДГ усиливается во втором слое - на 49,7 % (Z=-3,13; p=0,002), в третьем слое - на 35,9 % (Z=-3,13; p=0,002) и в пятом слое - на 25,6 % (Z=-3,13; p=0,002) по сравнению с контролем (рисунки 3.10, 3.11). Содержание РНК имеет тенденцию к снижению. После эксперимента ее количество у опытных животных уменьшается во втором слое - на 33,6 % (Z=3,13; p=0,002), в третьем слое - 23,3 % (Z=3,13; p=0,002) и в пятом слое - 22,9 % (Z=3,13; p=0,002) по сравнению с контрольными данными (рисунки 3.12-3.19).
Через 45 суток обнаружено достоверное изменение активности ферментов только в третьем слое коры: для Г-6-ФДГ выявлено её снижение на 14,5 % (Z=2,24; p=0,025), для КФ и ЛДГ повышение соответственно на 11,3 % (Z=-2,36; p=0,018) и 6,6 % (Z=-2,24; p=0,025), и снижение содержания РНК - на 6,5 % (Z=-1,98; p=0,048)[29].
У животных через 90 суток после начала эксперимента не обнаружено статистически значимых изменений активности ферментов и содержания РНК в перикарионах нейронов[16].
Рисунок 3.8 - Активность СДГ в нейронах 2 слоя теменной коры[16]: активность СДГ в нейронах 2 слоя теменной коры мозга крыс в контроле - А и снижение ее в опыте - Б Окраска по Нахласу и др. Ув. 400.
Рисунок 3.9 - Активность СДГ в нейронах 5 слоя фронтальной коры[16]: активность СДГ в нейронах 5 слоя фронтальной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции)и снижение ее в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Нахласу и др. Ув. 800. Цифровая микрофотография
Рисунок 3.10 - Активность НАДН-ДГ в нейронах 2 слоя теменной коры[16]: активность НАДН-ДГ в нейронах 2 слоя теменной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение ее в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Нахласу, Уокеру, Зелигману. Ув. 400. Цифровая микрофотография
Рисунок 3.11 - Активность НАДН-ДГ в нейронах 3 слоя теменной коры[16]: активность НАДН-ДГ в нейронах 3 слоя теменной коры крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение ее в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Нахласу, Уокеру, Зелигману. Ув. 800.
Рисунок 3.12 - Активность НАДН-ДГ в нейронах 5 слоя теменной коры мозга[16]: активность НАДН-ДГ в нейронах 5 слоя теменной коры крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Нахласу, Уокеру, Зелигману. Ув. 400. Цифровая микрофотография
Рисунок 3.13 - Активность Г-6-ФДГ в нейронах 5 слоя теменной коры[16]: активность Г-6-ФДГ в нейронах 5 слоя теменной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Гесс, Скарпели, Пирсу. Ув. 300. Цифровая микрофотография
Рисунок 3.14 - Активность КФ в нейронах 2, 3, 5 слоёв фронтальной коры[16]: активность КФ в нейронах 2, 3, 5 слоёв фронтальной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и повышение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Гомори. Ув. 100. Цифровая микрофотография
Рисунок 3.15 - Активность ЛДГ в нейронах 2 слоя теменной коры[16]: активность ЛДГ в нейронах 2 слоя теменной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Гесс, Скарпели, Пирсу. Ув. 400. Цифровая микрофотография
Рисунок 3.16 - Активность ЛДГ в нейронах 3 слоя теменной коры[16]: активность ЛДГ в нейронах 3 слоя теменной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Гесс, Скарпели, Пирсу. Ув. 1000.
Рисунок 3.17 - Содержание РНК в нейронах 2 слоя теменной коры[16]: содержание РНК в нейронах 2 слоя теменной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Эйнарсону. Ув. 1000. Цифровая микрофотография
Рисунок 3.18 - Содержание РНК в нейронах 3 слоя теменной коры[16]: содержание РНК в нейронах 3 слоя теменной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Эйнарсону. Ув. 1000. Цифровая микрофотография
Рисунок 3.19- Содержание РНК в нейронах 5 слоя теменной коры[16]: содержание РНК в нейронах 5 слоя теменной коры мозга крыс в контроле - А (10 суток после ложной операции) и снижение её в опыте - Б (10 суток холестаза). Окраска по Эйнарсону. Ув. 1000. Цифровая микрофотография
Таким образом после перевязки общего жёлчного протока у крыс в теменной коре мозга развиваются несколько более глубокие структурные и гистохимические изменения по сравнению с фронтальной корой[29].
ГЛАВА 4. ЯДЕРНЫЙ БЕЛОК НЕРВНЫХ КЛЕТОК NEUN
Белок NeuN локализуется в ядрах и перинуклеарной цитоплазме большинства зрелых нейронов ЦНС млекопитающих. NeuN был открыт в 1992 году группой исследователей, получившей моноклональные антитела (клон А60), выявлявшие этот известный ранее ядерный белок [17]. Антитела к NeuN позволяют выявлять нейроны, но не связываются с глиальными клетками. Синтез белка NeuN начинается в постмитотических нейробластах на достаточно поздних стадиях дифференцировки [18]. Следует отметить, что этот маркер не вполне применим при изучении развития нервных клеток мозжечка, поскольку он не синтезируется в клетках Пуркинье и некоторых нетипичных нейронах коры мозжечка [19]. Для выявления последних в качестве селективных нейрональных маркеров могут быть использованы кальбиндин и кальретинин.
Из оригинальной работы Mullen и соавторов [21] следовало, что экспресия этого белка связана с нейрональной дифференцировкой и созраняется в течение всей жизни клеток, что в свою очередь указывало на роль этого белка как постоянного регулятора общих проявлений нейронального фенотипа. Однако, несмотря на продолжительное использование антител к белку NeuN в практике научных исследований и клинико-диагностических исследований [22-25] конкретные функции данного белка в нервных клетках долгое время оставались непонятными.
Ранее было описано в исследованиях профессора Зиматкина, что у потомства крыс с холестазом, вызванным на 17-сутки беременности нарушается морфогенез палеоцеребеллюма. В раннем периоде постнатального развития это выражается в торможении роста коры, нарушении динамики развития наружного зернистого слоя, размеров перикарионов и плотности расположения клеток Пуркинье. В более позднем периоде онтогенеза это проявляется в уменьшении количества нормохромных клеток Пуркинье и увеличении гиперхромных, а также содержания в их цитоплазме рибонуклеопротеинов.
На 2-15 сутки в нейронах наружного зернистого слоя у потомства крыс с холестазом обнаружено отставание убыли экспрессии даблкортина, который является маркером незрелых нейронов, а во внутреннем зернистом слое - уменьшение плотности расположения иммунопозитивных по NeuN нейронов, замедление нарастания в них экспресии NeuN. Это свидетельствует о замедлении миграции нейронов из наружного зернистого слоя и формирования внутреннего зернистого слоя в постнатальном онтогенезе[20].
При электронно-микроскопическом исследовании клеток Пуркинье палеоцеребеллюма 7и 15-суточных крысят группы «холестаз» ГрЭС развита хуже, чем в контроле, обнаруживалась ее дезорганизация, на цистернах меньшее количество рибосом, наблюдались участки цитоплазмы, заполненные преимущественно многочисленными свободными рибосомами и полисомами, что свидетельствует о замедлении дифференцировки клеток Пуркинье. Митохондрии характеризовались полиморфизмом, наблюдалась их гипертрофия, в некоторых просветление матрикса, очаговый лизис крипт, увеличение числа лизосом, которые контактируют и измененными митохондриями. Наблюдались тесные контакты митохондрий с органеллами. В некоторых клетках Пуркинье наблюдалось расширение цистерн гладкой эндоплазматической сети. В ядре наблюдается усиленный выход субъединиц рибосом в цитоплазму. На 45 сутки цитоплазма гиперхромных клеток Пуркинье более осмиофильна, имеется большое количество свободных рибосом и уменьшение связанных, митохондрии имели просветленный матрикс с нечеткими кристами, гипертрофия эндоплазматической сети и комплекса Гольджи[20].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В исследовании лигирование общего желчного протока у крыс индуцирует временное увеличение (на 5-й и 10-й день) экспрессии синаптофизина в молекулярном слое коры мозжечка. Большинство синапсов образованы терминалами аксонами гранулярной клетки (параллельные волокна) на дендритах клеток Пуркинье. Syn, интегральный мембранный белок синаптических везикул, встречается во всех нервных окончаниях и участвует в синаптической передаче [11,12], играя важную регуляторную роль в образовании синапсов [13]. Временное увеличение синаптофизина в молекулярном слое мозжечка может отражать усиленный синаптогенез, увеличение количества синаптических пузырьков в синапсах, что является компенсаторной реакцией. Холестаз, который приводил к гибели гранулярных клеток и клеток Пуркинье [8], структурные и метаболические нарушения в мозжечковых клетках Пуркинье, появились на 5-й день после перевязки желчных протоков. Он достиг максимума в 10-20 дней и уменьшился в 45-90-е дни. В исследовании, проведенном в 20-90-е дни после лигирования желчного протока, экспрессия синаптофизина в молекулярном слое коры мозжечка не отличалась от экспрессии в контрольной группе. Восстановление может быть объяснено ростом новых добавочных желчных протоков.
Увеличение экспрессии глутаматдекарбоксилазы в выживших ГАМК-эргических клетках Пуркинье на 5-20-й день холестаза указывает на их активацию. Увеличение экспрессии глутаматдекарбоксилазы вокруг их тел указывает на активацию клеток ГАМК-эргической области, которые могут компенсировать гиперрезистентные клетки Пуркинье, возможно, для поддержки функций мозжечка.
В заключение, холестаз у крыс индуцирует увеличение экспрессии синаптофизина и глутаматдекарбоксилазы в коре мозжечка, необходимых для поддержки функций мозжечка.
В раннем периоде постнатального развития это выражается в торможении роста коры, нарушении динамики развития наружного зернистого слоя, размеров перикарионов и плотности расположения клеток Пуркинье. В более позднем периоде онтогенеза это проявляется в уменьшении количества нормохромных клеток Пуркинье и увеличении гиперхромных, а также содержания в их цитоплазме рибонуклеопротеинов.
На 2-15 сутки в нейронах наружного зернистого слоя у потомства крыс с холестазом обнаружено отставание убыли экспрессии даблкортина, который является маркером незрелых нейронов, а во внутреннем зернистом слое - уменьшение плотности расположения иммунопозитивных по NeuN нейронов, замедление нарастания в них экспресии NeuN. Это свидетельствует о замедлении играции нейронов из наружного зернистого слоя и формирования внутреннего зернистого слоя в постнатальном онтогенезе.
После перевязки общего жёлчного протока у крыс во фронтальной коре мозга развиваются глубокие структурные и гистохимические изменения. Незначительные изменения отдельных параметров появляются на 2-5 сутки опыта, а достигают максимального уровня они через 10-20 суток. Затем у выживших животных, у которых образуются обходные жёлчевыводящие пути и холестаз исчезает, постепенно нормализуется. К отдалённым последствиям холестаза (90 сутки) можно отнести очаги отсутствия нейронов во всех слоях фронтальной коры, уменьшение в них общего числа нейронов и увеличение числа глиальных клеток. Это свидетельствует о тяжелых морфо-функциональных нарушениях во фронтальной коре мозга при холестазе у крыс, что приводит к гибели части её нейронов. С другой стороны, в сохранившихся нейронах развиваются значительные адаптационные изменения, ведущие к восстановлению структуры и метаболизма нейронов в отдалённые сроки после устранения холестаза[28].
После перевязки общего жёлчного протока у крыс в теменной коре мозга развиваются несколько более глубокие структурные и гистохимические изменения по сравнению с фронтальной корой. Они также развиваются постепенно и максимального уровня достигают через 10-20 суток. После 45 суток (у выживших животных) они частично нормализуются, а через 90 суток в сохранившихся нейронах - полностью нормализуются. В отдаленные сроки в коре определены очаги отсутствия нейронов во всех слоях, уменьшение в них общего числа нейронов, но увеличение числа глиальных клеток[29].
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1.Болезни печени и желчевыводящих путей. Под ред. В.Т. Ивашкина. М.: Медицина, 2005.
2.Green J, Beyar R, Bomzon L, Finberg JP, Better OS (1984) Jaundice, the circulation, and the kidney. Nephron 37: 145-152. [Crossref]
3.Greenwood J, Adu J, Davey AJ, Abbott NJ, Bradbury MW (1991) The effect of bile salts on the permeability and ultrastructure of the perfused, energy-depleted, rat blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab 11: 644-654. [Crossref]
4.Ostrow JD, Pascolo L, Shapiro SM, Tiribelli C (2003) New concepts in bilirubin encephalopathy. Eur J Clin Invest 33: 988-997. [Crossref]
.Grojean S, Koziel V, Vert P, Daval JL (2000) Bilirubin induces apoptosis via activation of NMDA receptors in developing rat brain neurons. Exp Neurol 166: 334-341.
6.Francavilla R, Miniello VL, Brunetti L, Lionetti ME, Armenio L (2003) Hepatitis and cholestasis in infancy: clinical and nutritional aspects. Acta Paediatr Suppl 91: 101-104. [Crossref]
.Emelyanchik SV, Zimatkin SM (2014) Structural and histochemical changes in Purkinje cells in the rat cerebellum in cholestasis. Neurosci Behav Physiol 44: 467-471.
.Lin SZ, Yan C, Wei X, Paul SM, Du YS (2003) p38 MAP kinase mediates bilirubin-induced neuronal death of cultured rat cerebellar granule neurons. Neurosci Lett 353: 209-212.
.Zarubin T, Han J (2005) Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway. Cell Res 15: 11-18. [Crossref]
10.Надинская М.Ю. Заболевания печени, протекающие с синдромом внутрипеченочного холестаза. Consilium medicum 2001; 4 (6): 286-92.
11.Gores GJ. Mechanisms of cell injuri and death in cholestasis and hepatoprotection by ursodeoxycholic acid. J Hepatol 2002; 32 (Suppl. 2): 11-3.
.Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. Норма и патология. Учебник. - 3-е изд., М., Медицина, 2010. - 752 с.
.Хаитов P.M., Игнатьева Г.Л., Сидорович И.Г. Иммунология. Учебник // Москва. Медицина. - 2000. 432 с.: илл.
.Хаитов Р.М., Ярилин А.А., Пинегин Б.В. Иммунология. Атлас. М. 2011 г. 624с.
15.Karnyushko, O.A., Zimatkin, S.M. Synaptophysin and glutamate decarboxylase expression in the rat cerebellum structures in cholestasis // Brain Nerves. - 2017. - Vol. 1, № 2. - Р.1-3.
16.Емельянчик, С.В., Зиматкин, С.М. Мозг при холестазе: монография. - Гродно : Гродненский государственный университет , 2011. - 265 с.
17.Mullen R. J., Buck C. R., Smith A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates // Development. 1992. Vol. 116. № 1. P. 201-211.
18.Коржевский Д. Э., Петрова Е. С., Кирик О. В., Отеллин В. А. Оценка дифференцировки нейронов в эмбриогенезе крысы с использованием иммуноцитохимического выявления даблкортина // Морфология. 2008. Т. 133. № 4. С. 7-10.
19.Wolf H. K., Buslei R., Schmidt-Kastner R. et al. NeuN: a useful neuronal marker for diagnostic histopathology // J. Histochem. Cytochem. 1996. Vol. 44. № 10. P. 1167-1171.
20.Карнюшко, О.А. Нарушения развития нейронов мозжечка у потомства крыс с холестазом и их коррекция УДХК / О.А. Карнюшко, С.М. Зиматкин // Новости мед.-биол. Наук. 2016. Т. 12, №4. С. 185-190.
.Mullen R. J., Buck C. R., Smith A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates / Development. 1992. V. 116. P. 201-211.
.Hess D. C., Hill W. D., Martin-Studdard A., Carroll J., Brailer J., Carothers J. Bone marrow as a source of endothelial cells and NeuN-expressing cells after stroke / Stroke. 2002. V. 33. P. 1362-1368.
.Tanvig M., Blaabjerg M., Andersen R. K., Villa A., Rosager A. M., Poulsen F. R., Martinez-Serrano A., Zimmer J., Meyer M. A brain slice culture model for studies of endogenous and exogenous precursor cell migration in the rostral migratory stream / Brain Res. 2009. V. 1295. P. 1-12.
.Weyer A., Schilling K. Development and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum / J. Neurosci. Res. 2003. V. 73. P. 400-409.
.McPhail L. T., McBride C. B., McGraw J., Steeves J. D., Tetzlaff W. Axotomy abolishes NeuN expression in facial but not rubrospinal neurons / Exp. Neurol. 2004. V. 185. P. 182-190.
.Williamson, C. Intrahepatic Cholestasis of Pregnaney / С. Williamson, V.L. Geenes// Obstet. Gynecol. - 2014. - Vol. 124, N. 1. - P. 120-133.
27.Дудук, Н. И. Холестаз беременных и его последствий для матери и потомства / Н. И. Дудук, С. М. Зиматкин// Журн. ГрГМУ. - 2011. №1. - С. 3-6.
.Емельянчик, С.В., Зиматкин, С.М. Структурные и гистохимические изменения в нейронах теменной коры мозга крыс при подпеченочном холестазе // Новости медико-биологических наук. №1 (Т.7), 2013. - С. 38-44.
.Емельянчик, С.В. Гистохимические изменения в нейронах 2 и 3 слоев фронтальной коры головного мозга при 10-суточном экспериментальном холестазе у крыс / С.В. Емельянчик, С.М. Зиматкин, П.И. Суходольский // Актуальные проблемы экологии - 2007: тезисы докладов III Международной научно-практической конференции, г. Гродно, 21 23 ноября 2007 г./Учреждение образования «Гродненский гос. ун-т им. Я.Купалы»; отв. ред. Н. Канунникова. - Гродно : ГрГУ, 2007. - С.92-93.